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Elisa試劑盒實驗中的溫育環(huán)節(jié)需要注意哪些要點?
點擊次數(shù):800 更新時間:2022-09-26
  溫育是Elisa試劑盒的測定中影響測定成敗較為關鍵的一個因素。ELISA作為一種固相免疫測定,抗原抗體的結合反應在固相上進行,要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結合,必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比,即溫度越高,則所需時間相對較短。較為常用的溫育溫度有37℃和室溫,其次是43℃和2~8℃。
 
  溫育這一步是臨床ELISA測定中較容易出現(xiàn)問題的步驟。通常目前國內ELISA商品試劑盒的反應溫育時間為37℃30分鐘~1小時,進口ELISA試劑盒則通常為37℃1~2小時才能有較*的結合,低于1小時,可能會影響測定下限。因此,關于溫育,在實際測定操作中一定要注意以下幾點:
 
  1、要保證在設定的溫度下有足夠的反應時間。
 
  一般來說,加完樣本和/或反應試劑后,將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時,孔內溫度從室溫升至37℃,需要一定的時間,尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態(tài)下,這段升溫時間可能還比較長,而在臨床實驗室中,很少有人注意這個問題,通常是將微孔板一放入溫箱即開始計時,這樣就很容易造成實際測定中溫育時間不夠,弱陽性樣本測不出來的問題。曾有一地處南方的血站同行提出了一個問題,就是在每一年的冬季總有那么一個多月的時間,在做HBsAg測定的室內質控中,測定由衛(wèi)生部臨床檢驗中心供應的1 ng/ml弱陽性樣本時,總是測不出來,不知原因為何?這可能就與南方冬天室內溫度較低有關,此時微孔板轉入溫箱后37℃溫育時間不夠,以致弱陽性樣本測定為陰性。因此,為保證37℃下足夠的溫育時間,臨床實驗室可自行確定本實驗室不同季節(jié)(不同室溫下)微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長時間孔內溫度才能達到37℃,從而適當延長板條在溫箱中的放置時間。具體的做法是,用一小溫度計放置板孔反應溶液中測量觀察即可。
 
  2、溫育溫度的選擇。
 
  在有的ELISA試劑盒的說明書中,指出溫育溫度可有兩種,例如,一種是37℃下1小時,另一種則為43℃下45分鐘。從免疫測定的抗原抗體反應的本質來看,在較低的溫度下反應較長的時間較為*。如2~8℃下反應24小時。較高的反應溫度,由于分子運動的加憐惜,反應時間縮短,這一點對分子含量較多的強陽性樣本的測定沒有問題,但對分子含量少的弱陽性樣本則有漏檢的可能。因此,我們建議在臨床ELISA測定中盡量使用較低溫育溫度較長反應時間的條件。
 
  3、“邊緣效應”的排除。
 
  以前在使用96孔板的ELISA測定中,常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應”,即外周孔顯色較中心孔深,產生這種“邊緣效應”的原因可能為96孔板周孔與中心孔表面或熱力學特征的不同。但有研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導體,在實驗室的常規(guī)ELISA測定中,將板從室溫(通常在25℃左右)置于37℃溫箱,板也升溫時,在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。因此使用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時,將板和溶液均加熱至溫育溫度(如37℃),就可以很容易地排除“邊緣效應”,并且可提高測定的重復性。

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