要牢記ELISA試劑盒的操作流程
點擊次數(shù):992 更新時間:2016-04-26
ELISA試劑盒操作流程如下:
?。ǎ┐郎y樣品孔中每孔加入待測樣品00μl,每種樣品設(shè)3個平行孔;設(shè)兩個陰性對照孔,每孔加未處理組的細胞裂解液00μl;另設(shè)一個空白對照孔,加入純細胞裂解液00μl。?。?)酶標板置4℃,包被過夜。
?。?)洗板:吸干孔內(nèi)反應(yīng)液,用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后,即甩去),之后將洗滌液注滿板孔,浸泡-2分鐘,間歇搖動。甩去孔內(nèi)液體后在吸水紙上拍干。重復(fù)洗滌3-4次。
?。?)陰性對照孔每孔加入PBS 50μl,樣品孔及空白孔每孔加入:500稀釋的兔抗人AIF抗體工作液50μl。
?。?)酶標板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min。
?。?)洗板,同(4)。
?。?)每孔加:5000稀釋的HRP-標記的山羊抗兔抗體工作液 00μl。
?。?)酶標板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min。
?。?)洗板,同(4)。
(0)每孔加TMB顯色液 00μl,輕輕混勻0s,置37℃暗處反應(yīng)5-20min。
()每孔加00μl 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。
?。?)分別測450nm 吸光值W和630nm吸光值W2,zui終測得的OD值為兩者之差(W-W2),以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。
?。?)數(shù)據(jù)處理:在得出標本(S)和陰性對照(N)的 OD值后,計算S/N值。S/N≥2.為陽性判定標準。
注:所用溶液配方
?。ǎ?PBS:稱取0.2g KH2P04, 2.9g Na2HP04?2H20、8.0g NaCl, 0.2g KCl,加雙蒸水至000ml。
?。?)包被緩沖液:稱取.59g Na2CO3, 2.938 NaHCO3,加雙蒸水至 000m。
(3)洗滌液(PBST):含0.05% Tween-20的PBS。
?。?)稀釋液:含0.%牛血清白蛋白(BSA)的PBS,主要用以稀釋抗體、標準品、樣品。
?。?)TMB顯色液:稱取.84g Na2HP04.2H20, 0.5 g檸檬酸,加雙蒸水至O0ml,配成檸檬酸-磷酸緩沖溶液。用0.5 ml 檸檬酸-磷酸緩沖溶液溶解錠TMB,再加入35μl 3% H2O2
?。?)細胞裂解液:% TritonX-00,37mmol/L NaCl,20mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA,mmol/L PMSF,pH 7.4。(其中PMSF溶于異丙醇中,配成O mmo/L,-20℃ 貯存?zhèn)溆谩?/div>
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